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超速离心法

Differential Ultracentrifugation

🧪 样本处理与分离 板块|演示环境 · 内容持续校订中

一句话总结：最经典的外泌体分离方法，通过逐级提高离心力将囊泡与其他成分按沉降速度分开。

原理

利用不同颗粒的沉降速度差异：低速离心去除细胞与碎片，中速去除大囊泡，100,000×g 超速离心使纳米级外泌体沉降至管底。无需特殊试剂、处理量大，是文献中使用率最高的方法。

材料与试剂

  • 超速离心机（如 Hitachi CP100MX）及配套转子
  • 0.45 μm PVDF 滤膜
  • 预冷无菌 PBS（低内毒素）
  • 冷冻离心机

详细步骤（可照做）

共 7 步 · 参数以标准样本量为准，请按实际情况等比调整

  1. 1

    样本 37 ℃ 快速融化后立即置冰上预冷。

  2. 2

    4 ℃、2,000×g 离心 30 min，沉淀去除残留细胞与大碎片。

  3. 3

    小心吸取上清至新管，4 ℃、10,000×g 离心 45 min，去除大颗粒囊泡（微泡）与凋亡小体。

  4. 4

    上清经 0.45 μm 滤膜过滤，滤液移入超离管并严格配平。

  5. 5

    4 ℃、100,000×g 超速离心 90 min，使外泌体沉降至管底。

  6. 6

    弃上清，加 1.5 mL 预冷 PBS 重悬沉淀洗涤，再次 100,000×g 离心 30 min。

  7. 7

    彻底弃上清，用适量预冷 PBS 轻轻重悬沉淀即得纯化外泌体；分装后 −80 ℃ 保存。

关键参数速查

关键离心力100,000×g（约 40,000 rpm，视转子而定）
温度全程 4 ℃
重悬体积1.5 mL PBS / 管
适用样本量50 mL 上清起

⚠️ 常见坑与避坑指南

  • 超离管必须严格配平，偏差 >0.1 g 可能损坏转子
  • 重悬时用移液器轻柔吹打，剧烈涡旋会破坏囊泡
  • 共沉淀的杂蛋白较多——对纯度要求高时应升级为蔗糖垫或密度梯度
  • 反复冻融会显著降低囊泡完整性，务必分装保存

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本项目服务：超速离心（经典流程）含税参考价：200 元/50mL周期：3 个工作日
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