Western Blot 标志蛋白鉴定

原理

外泌体富含四跨膜蛋白（CD9/CD63/CD81）与 ESCRT 通路蛋白（TSG101、Syntenin）；同时应阴性排除内质网污染（Calnexin）——动物样本如此；植物样本则需排除 RuBisCO 与 AE1 叶绿体污染。一正一负两组抗体构成 MISEV 要求的 cargo 层证据。

材料与试剂

• RIPA 裂解液（含 PI/PMSF）
• BCA 定量试剂盒（碧云天 P0011）
• PVDF 膜（Millipore IPVH00010）
• 抗体组合：CD9(BOSTER BM4212)/CD63(Abclonal A19023)/CD81(SAB 41779)/TSG101(Abclonal A5789)/Syntenin(Abcam ab19903)/Calnexin(SAB 40669)，均 1:1000

详细步骤（可照做）

共 8 步 · 参数以标准样本量为准，请按实际情况等比调整

1. 1

   RIPA 冰上裂解 30 min，4 ℃、13,300×g 离心 15 min 取上清。

2. 2

   BCA 定量，统一各样本上样浓度。

3. 3

   4:1 加入 5× Loading Buffer，100 ℃ 变性 10 min。

4. 4

   按目标蛋白分子量选胶：15–40 kDa 用 12% 分离胶（CD 家族在此区间）。

5. 5

   80 V 浓缩 → 100 V 分离电泳。

6. 6

   PVDF 甲醇活化 20 s，湿转 300 mA 恒流（约 1 kDa ≈ 1 min）。

7. 7

   快速封闭液室温 30 min → 一抗 4 ℃ 过夜 → TBST 洗 3×10 min → 二抗(1:2000) 室温 2 h → 再洗 3 次。

8. 8

   ECL 显色曝光成像。

关键参数速查

⚠️ 常见坑与避坑指南

• 外泌体蛋白总量少，上样量不足是最常见的条带弱原因
• 负标阳性 = 样本被污染，应回头优化分离工艺而不是回避
• 植物样本跑出 RuBisCO 大条带说明叶绿体去除不彻底