服务项目

实验介绍

       外泌体的分离纯化技术主要包括超速离心法（ultracentrifugation，UC）、聚合物沉淀法（polymer precipitation）、切向流过滤法（tangential flow filtration，TFF）、超滤回收（Ultrafil-tration，UF）、尺寸凝胶排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）、免疫亲和层析（immunoaffinity chromatography）。超速离心法作为外泌体分离相对金标的方法，目前发文数量最多，在实际分离实验中可根据样品体积、下游实验、硬件配置等实际情况来不同的处理方案，以达到最佳的分离效果和成本控制。

       当前实验室配置有超速离心机、自动化外泌体提纯系统、切向流超滤系统、尺寸排阻色谱柱纯化系统等设备来实现外泌体的分离纯化，单批次可处理从100微升-100L的上清液，并可完成下游的鉴定分析、纯度和污染质控以及冷冻干燥等加工工艺。

1.  超速离心（UC）

       普通差速离心是一种最常用的外泌体分离纯化方法。首先将细胞培养上清离心，去除细胞碎片和大颗粒物，然后使用高速离心，将外泌体沉淀下来。最后用PBS或其他缓冲液进行洗涤，得到纯净的外泌体。在普通超离的基础上让外泌体再一次穿过蔗糖垫进行超离，可有效提高外泌体的纯度，适合于乳汁等脂蛋白含量较高的样品。若希望得到纯度极高的外泌体，推荐采用碘克沙醇的密度梯度超速离心，该方法可根据外泌体与杂质粒子之间的密度差异进行分离，收集对应介质（外泌体密度在1.13-1.19 g/mL）可达到最佳纯度。

2.  切向流浓缩（TFF）+尺寸排阻色谱柱（SEC）

       传统过滤方法液体流动方向与过滤方向一致（死端过滤），导致滤膜表面颗粒堆积，过滤性能降低。而切向流过滤将液体的流动方向改为平行于滤膜表面，上清液反复循环流经滤膜表面，被膜滞留的外泌体将持续通过循环流路，透过液则被除去，进而达到纯化浓缩外泌体的目的。而尺寸排除色谱法是一种利用孔径较小的柱子将外泌体分离的方法。将样品通过柱子时，孔径较小的柱子可以筛选掉较大的细胞和细胞碎片，而小于孔径的外泌体则通过柱子。该方法可以同时分离不同大小的外泌体，但相对其他方法来说，流程复杂且比较耗时。切向流过滤法结合尺寸排阻色谱已被证实在产量、重现性、时间、成本和可扩展性方面都超过了超速离心，是目前分离大体积样本获取高纯度外泌体相对主流的解决方案。

3.  全自动外泌体提纯系统（EXODUS）

       EXODUS全自动外泌体提纯系统基于负压振荡系统(NPO)结合双耦合谐波振荡系统(HO)作用于纳米超滤芯片原理，使样本中的游离核酸与蛋白等杂质通过纳米孔快速去除并截留外泌体，从而纯化富集外泌体，已在期刊杂志Nature Methods、PNAS、ACS Nano等发表专业论文10余篇。

4.  全自动外泌体膜感应肽磁珠捕获系统（EXO-Smart）

       外泌体极小的半径（30-150nm）造成表面高度弯曲并且存在大量带负电的不饱和磷脂，如磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS），以及脂质堆积缺陷。经过特异设计的环状多肽含有多个正电荷氨基酸（如Lysine，Arginine等），可以与外泌体表面富集的负电性磷脂发生静电相互作用，多肽特异性结合磷脂并嵌入到脂质堆积的缺陷中，同时环状结构的多肽可以感应识别膜的高曲率从而对符合外泌体尺寸的颗粒（30-150nm）有更高的选择性。通过设计高特异性的膜感应肽与磁珠进行偶联，然后通过自动化的磁珠提取设备来实现外泌体的捕获和洗脱，所得外泌体的纯度可媲美超速离心的外泌体，并在产量方面有所提高。