基础实验方案

A · PDEVs 分离与基础表征（委托生命互联）

1. 1新鲜生姜 200 g 去皮切块，按 1:2（w/v）加入预冷 PBS，组织匀浆机低速匀浆 3×30 s。
2. 2差速离心逐级去杂质：300×g 10 min → 2,000×g 20 min → 10,000×g 30 min（全程 4 ℃）。
3. 3上清经 0.22 μm 滤器除菌过滤，100 kDa 超滤管（MWCO）4 ℃ 浓缩至约 500 μL；PBS 重洗 2 次，去除游离蛋白与小分子干扰。
4. 4表征三件套：NTA 测粒径分布与颗粒浓度；磷钨酸负染色 TEM 确认典型杯盘状形貌；BCA 法测定总蛋白浓度。
5. 5按 100 μL/管分装，−80 ℃ 冻存，禁止反复冻融；每批留取质控样。

B · 细胞培养与处理

1. 1C2C12 成肌细胞于 DMEM + 10% FBS 培养；铺板后换含 2% 马血清的分化培养基诱导成肌管，分化第 5 天用于实验。
2. 2正式实验前先做安全剂量摸索：PDEVs 按 0 / 5 / 10 / 25 / 50 μg/mL 处理 24 h，CCK-8 确定活力≥90% 的剂量范围。
3. 3分组处理（见上表），设 24 h 与 48 h 两个时间点；每组 n=3 生物学重复，独立重复实验 2 次。

C · 线粒体功能检测（核心指标）

1. 1膜电位：JC-1 试剂盒，37 ℃ 染色 20 min，荧光酶标仪读取红/绿荧光比值（ΔΨm 的经典指示）。
2. 2ATP 含量：萤光素酶法 ATP 检测试剂盒，裂解后上机读数，结果以 nmol ATP/mg protein 归一化。
3. 3线粒体质量与形态：MitoTracker Green 活细胞染色，共聚焦成像；ImageJ 定量平均荧光强度。
4. 4线粒体 ROS：MitoSOX Red 染色 10 min，流式或荧光酶标仪定量。

D · 分子标志物验证

1. 1qPCR 检测线粒体生物合成通路：PGC-1α、NRF1、TFAM、COX IV；以 GAPDH 内参，2^−ΔΔCt 法分析。
2. 2Western Blot：总 OXPHOS Complexes I–V 混合抗体 + PGC-1α；RIPA 裂解、BCA 定量上样 20 μg/泳道。
3. 3统计：多组间单因素方差分析（ANOVA）+ Tukey 事后检验；显著性阈值 p＜0.05；数据 mean ± SEM。