外泌体课题研究方案书

1.1 原料预处理与匀浆

1. 1市售新鲜生姜根茎 500 g×4 批次，流水洗净→75% 酒精表面擦拭 30 s→无菌 PBS 冲洗 3 次（降低微生物与外源 RNA 污染）。
2. 2去皮切块后按 1:2（w/v）加入预冷 PBS（含 0.1% EDTA、1 mM PMSF），组织匀浆机 12,000 rpm 处理 3×30 s，每间隔 30 s 置冰 1 min。

💡 参考 [6]：后续可采用低 pH（pH 4–5）PEG6000 沉淀法将产量提高 4–5 倍，作为放大备选工艺。

1.2 差速离心逐级去杂质

1. 1300×g 10 min（4 ℃）弃沉淀 → 2,000×g 20 min 去细胞碎片 → 10,000×g 30 min 去大囊泡与淀粉颗粒。
2. 2每级离心间用 0.22 μm 滤器过滤上清；记录各级体积用于产率核算。

1.3 精纯（二选一或串联）

1. 1路线 A（论文金标准）：100 kDa TFF 切向流浓缩至 1/20 体积 → 碘克沙醇不连续密度梯度（8%/30%/45%，110,000×g 100 min），吸取 1.13–1.19 g/mL 富集带，PBS 透析去除蔗糖。
2. 2路线 B（放大备选）：PEG6000 低 pH 沉淀法（pH 4.5，8% PEG，4 ℃ 过夜）→ 10,000×g 收沉淀 → SEC 尺寸排阻柱纯化。
3. 3终产物以 100 kDa 超滤管置换缓冲液至 PBS，0.22 μm 除菌过滤。

💡 路线 A 用于表征与测序批次；路线 B 用于动物给药批次并同步做两批质量对比（为审稿人「批次一致性」质疑预留证据）。

1.4 MISEV2023 合规鉴定

1. 1TEM 负染色（磷钨酸）确认杯盘状形貌，≥15 个独立视野；有条件加做 Cryo-TEM。
2. 2NTA 测粒径分布（目标峰 80–200 nm）与颗粒浓度；同批测 Zeta 电位。
3. 3WB 标志物：正标 PEN1、ALIX、TET8；负标 RuBisCO 大亚基与 AE1（叶绿体污染指标）。
4. 4Triton X-100（0.1%）处理后 NTA 颗粒数骤降 ≥80%，证实膜结构依赖性信号。
5. 5内毒素（LAL 法）<0.5 EU/mL、菌检阴性后方可用于细胞/动物实验。

💡 全部鉴定项满足 MISEV2023 对「单颗粒+群体+ cargo」三层次证据的要求 [7]。

1.5 内容物提取与小 RNA 测序

1. 1Trizol-LS 提取囊泡总 RNA（每库 ≥1×10⁹ 颗粒当量），Agilent Bioanalyzer Nano 芯片质检。
2. 2构建小 RNA 文库（Illumina PE150），共 6 库 = 2 批次 × 3 重复；clean data ≥20 M reads/库，Q30 ≥90%。
3. 3生信流程：Cutadapt 去接头 → UMI 去重 → miRDeep2 与 miRBase 比对鉴定已知 miRNA 并预测新 miRNA → TPM 归一化 → 批次间 DESeq2 差异分析。

1.6 候选功能 miRNA 挑选（核心决策点）

1. 1三重筛选标准：① 高丰度（TPM 前 20）；② 序列保守且在人/鼠基因组可找到种子区匹配靶点；③ 靶基因 GO/KEGG 富集显著落在氧化磷酸化、线粒体生物合成、糖脂代谢通路。
2. 2靶基因预测取 miRanda + TargetScan 交集；对候选通路做 miRNA-mRNA 调控网络图（Cytoscape）。
3. 3茎环 qRT-PCR 独立验证测序结果（ΔΔCt，U6 外参不适用植物样本时改用 cel-miR-39 spike-in）。
4. 4输出：3–5 个候选 miRNA 清单 + 每个的证据链卡片（丰度/保守性/靶点/文献支持），进入模块二功能验证。

💡 ★ 中期评审节点：若候选清单不理想，启用备选路径——转向蛋白组主导（TMT 定量锁定代谢酶类分子），测序数据仍可用于发表。

2.1 囊泡标记与摄取动力学

1. 1PKH26（膜染）/ DiO 按试剂盒比例标记 PDEVs，未结合染料用 SEC 柱去除（设染料-only 对照排除假阳性）。
2. 2与 C2C12 肌管共孵育 0.5 / 2 / 6 / 24 h，激光共聚焦观察摄取定位（DiO 膜融合 vs LysoTracker 内体途径区分）。
3. 3流式定量摄取阳性率与荧光中位强度，绘制时间-剂量曲线。

2.2 人工装载增强（agomir 电穿孔装载）

1. 1对天然丰度不足的候选 miRNA，合成 Cy3 标记 agomir，电穿孔仪程序优化（方波 150 V/50 μs vs 300 V/5 ms 两档对比）装载入 PDEVs。
2. 2装载效率测定：RNase A 消化胞外游离 miRNA 后提取囊泡内 RNA，qRT-PCR 定量（装载率 = 装载后/投入量）。
3. 3装载前后 NTA/TEM 复检粒径与形貌无显著改变方可使用。

💡 参考 [2][3]：柚皮纳米载体递送 miR-18a/miR-17 的成功范式——天然装载不足时人工装载是高分文章的标准做法。

2.3 递送的功能性读出

1. 1受体细胞处理 24 h 后检测靶 mRNA（qRT-PCR）与靶蛋白（WB）双层面下调幅度。
2. 2Ago2-RIP 或 biotin 标记 miRNA pull-down 证明 miRNA 进入 RISC 沉默复合体（高分文章加分证据）。
3. 3设立游离 miRNA agomir 对照组：证明同等剂量下游离形式效果弱于囊泡包裹形式（体现载体价值）。

3.1 细胞模型与分组

1. 1C2C12 成肌细胞分化为肌管（2% 马血清诱导 5 天，MyoG/MyHC 免疫荧光确认分化程度）。
2. 2造模：棕榈酸 PA 0.25 mM + 低糖 DMEM 处理 24 h 建立代谢应激模型。
3. 3六组设计（n=3，独立重复 2 次）：NC / PA 模型 / PA+PDEVs 低(5 μg/mL) / 高(25 μg/mL) / PA+二甲双胍 0.5 mM 阳性对照 / PA+RNase 预处理 PDEVs。

3.2 线粒体功能全谱检测

1. 1终点法：JC-1 膜电位（红/绿比）、ATP 萤光素酶法（nmol/mg protein 归一化）、MitoSOX 线粒体 ROS、MitoTracker Green 形态学定量。
2. 2动态法（标志性指标）：Seahorse XFe96 测 OCR/ECAR 全谱——基础呼吸、ATP 耦合效率、最大呼吸、储备呼吸能力；寡霉素/FCCP/鱼藤酮+抗霉素 A 三步加药，每板内置 NC 孔消除板间漂移。

3.3 通路机制（AMPK/PGC-1α 轴）

1. 1WB 时间 course：p-AMPKα(Thr172)/AMPKα、PGC-1α、NRF1、TFAM、COX IV、OXPHOS Complexes I–V（0.5/2/6/24 h）。
2. 2qPCR 同步验证 mRNA 层面（15 基因 panel，GAPDH/β-actin 双内参）。
3. 3免疫荧光：PGC-1α 核转位成像定量。

3.4 动物药效与体内分布

1. 1C57BL/6J 雄鼠 HFD（60% kcal fat）8 周成模，随机盲法分组 n=8×5 组：NC/HFD/HFD+低/HFD+高/HFD+二甲双胍。
2. 2灌胃给药 50/200 mg/kg·bw·d 连续 8 周；每周体重与摄食记录。
3. 3药效终点：空腹血糖、ITT、GTT、血清 ALT/AST/TG/TC；DIR 近红外活体成像示踪囊泡体内分布（给药 6/24/48 h）。
4. 4组织复验：腓肠肌 HE（肌纤维横截面积）、肝油红 O；腓肠肌/肝组织 WB+qPCR 复验 AMPK-PGC-1α 轴。

💡 伦理：全程执行 3R 原则，SPF 设施持证人员操作（生命互联承接）；伦理批件随投稿材料提交。

4.1 miRNA 层面的双向操控

1. 1Gain-of-function：单独转染候选 miRNA mimics（不加囊泡）模拟 PDEVs 效应——若能重现线粒体表型改善，说明 miRNA 是充分条件。
2. 2Loss-of-function：antagomir/miRZip 敲低内源 miRNA 后再给 PDEVs——若效应被阻断，说明 miRNA 是必要条件。
3. 3体内对应：HFD 小鼠尾静脉 antagomir 与 PDEVs 联合给药，观察药效是否被抵消（参考 [2] 中 siRNA-IL-12 共递送的对照设计逻辑）。

4.2 靶基因层面的直接结合证据

1. 1双荧光素酶报告系统：克隆靶 gene 3'UTR（含预测结合位点）于 psiCHECK-2 下游；共转 miRNA mimics 观察 Renilla/Firefly 比值下降。
2. 2突变对照：结合位点种子区定点突变（site-directed mutagenesis）后共转，若抑制效应消失则证明序列特异性直接结合。

4.3 靶基因功能回补

1. 1靶基因 ORF 过表达质粒（不含 3'UTR，免疫逃逸 miRNA 抑制）与 PDEVs 共处理——若过表达靶基因能逆转 PDEVs 的线粒体保护效应，完成「miRNA↓靶基因↓→表型」闭环。
2. 2反向：siRNA 敲低靶基因应模拟 PDEVs 效应（表型模拟试验）。

4.4 载体必要性与特异性对照

1. 1RNase 预处理 PDEVs（破坏囊泡内 RNA）→ 效应消失：证明活性依赖囊泡包裹的 RNA。
2. 2蛋白酶预处理 → 效应保留与否，辅助判断蛋白成分贡献度。
3. 3非相关植物囊泡（如葡萄来源）平行对照：证明效应的物种特异性而非通用纳米颗粒效应。